0 引言
21世纪是生命科学的时代。随着近年来科学技术的迅猛发展，生命组织和机体的自我生长和生物功能研究成为人类探索和利用的前瞻技术方向，制造技术与生命科学的交叉融合正在显示出其巨大的科技引领能力和未来产业价值。生命体的许多功能不断被认知，它在人体组织器官和未来工程领域都具有巨大的发展潜力。近年来，科学技术的发展逐渐呈现一个发展趋势——通过增材制造技术探索生命体的制造。它帮助人类与疾病和衰老抗争，为提升人的生存质量提供新技术。人体复杂器官制造是未来社会迫切需要发展的方向。近期《Science》杂志封面报道[1]，美国研究团队带来一项具有里程碑意义的发明：一个由水凝胶3D打印而成的肺模型，它具有与人体血管、气管结构相同的网络结构，能够像肺部一样朝周围的血管输送氧气，完成“呼吸”过程，这就体现了制造技术向具有呼吸运动和传输功能的制造技术发展的趋势。以色列科学家也打印出可以跳动的人工心脏。脑科学一直是科技研究的热点，人脑具有非逻辑思考功能，具有计算机无法实现的意识功能，是人类创新的物质基础。如果能探究认识脑功能与神经细胞的关系，进而培育和再生脑组织来发展类脑计算机，则能以极低的物质代谢产生巨大的创新和运算能力。随着人工智能的高速发展，类脑组织制造被提上研究日程。开展生命体的多尺度制造，即宏观结构-微观细胞-纳观基因，形成组织器官再造和基因可控制造，将有望利用生命体的自我生长功能和制造技术的设计构建能力，创造新的生命构件，为人类健康服务，并将以机器为载体的人工智能发展成为人脑再创的类人智能。
1 概念内涵
增材制造也被称为3D打印，是近三十年发展起来的新制造技术。3D打印的来源是三个几何维度(X-Y-Z)的可自由制造。随着技术的发展，4D打印概念由美国人于2013年提出，是指制造的构件可以随着时间而改变结构，增加了一个时间维度。卢秉恒院士提出了5D打印概念，认为除了结构随着时间而变化外，更加重要的是功能的改变与再生，增加了功能这一维度。这一观点将使传统的静态结构和固定性能的制造向着动态和功能可变的制造发展，突破传统的制造理念，向着结构智能和功能创生方向发展。目前已有的一些所谓自由曲面5D制造，是制造技术层面的五轴加工的含义，仍属于3D制造，与5D打印概念完全不同，不具有科学技术引领作用。5D打印仍采用3D打印技术设备，但是其打印材料是具有活性功能的细胞和生物因子等具有生命活力的材料，这些生物材料在后续发展中还要发生功能的变化，因此，必须从后续功能出发，在制造的初始阶段就进行全生命周期的设计。
5D打印这一科学技术的创新，将给制造技术、人工智能带来颠覆性的变革发展，将制造的目标产品从非生命体发展成可变形可变性的生命体。该技术在近期可为人体的器官更换和人的健康服务，在远期有望开创制造科学与生命科学的新方向，推动人工智能的划时代发展。5D打印技术将利用生物的能量、驱动能力、逻辑思维能力，为未来的机器装备发展提供低能耗、柔性自由驱动和类人智能技术提供新方向。
2 发展状况
5D打印的核心是制造具有生命功能的组织，为人类提供可定制化制造的功能器官组织。人工组织与器官制造技术是世界制造强国的重点支持领域，例如美国《2020年制造业挑战的展望》中将生物组织制造作为高新科技的主要方向之一；欧盟委员会《制造业的未来：2015—2020战略报告》提出重点发展生物材料和人工假体制造技术，并将生物技术列为支撑制造业未来发展的四大学科之一；日本机械学会技术路线图将微观生物力学对促进组织再生确定为10个研究方向之一。国内外在个性化人体替代物、薄膜类活性组织等制造领域已实现了部分临床应用与产业化，但在复杂活性组织与器官的工程化制造方面仍面临诸多挑战。目前全球已有超过300家专门从事生物3D技术研究和开发的研究机构和公司。其中，美国Wake Forest再生医学研究院在生物3D领域取得了一系列开创性成果：首次实现干细胞打印，并成功分化诱导生成功能性的骨组织；与美国军队再生医学研究所合作，开发出了3D皮肤打印机；3D打印出类似“人造肾脏”的结构体等。此外，国际上已开发出异质集成的血管网络结构、异质集成细胞打印设备，打印出了人颅骨补片、人耳软骨等含细胞异质结构。目前国内已经实现骨骼、牙齿、耳软骨支架、血管结构等的打印，并在临床上进行了初步应用；已经制造出胶质瘤干细胞模型、多细胞异质脑肿瘤纤维模型等。国内的清华大学、西安交通大学、浙江大学、华南理工大学、四川大学、吉林大学等在此方面开展了深入研究，在部分生物制造领域与国际先进水平的差距在不断缩小，甚至少数领域中还处于国际领先地位，然而目前国内整体技术水平还不高，核心技术与装置多以仿制为主，产业化时有较大的知识产权风险。特别是在源头技术创新及应用领域拓展方面还处于追赶阶段，具体体现在血管网络、皮肤、肝脏等复杂且关键组织器官的研究开发方面较为滞后，需要在重点领域和核心关键产品上加大研究力度并实现突破。
3 关键问题
5D打印是制造技术与生命科学技术的融合，有目的的设计制造与调控是5D打印的核心要点，其主要关键问题包括以下5个方面。
3.1 基于功能的生命体结构设计制造
在认识生命体自我生长特性的基础上，需发展细胞和基因尺度的单元原始态和生长过程的结构与功能设计理论。其主要难点包括：
(1)突破现有的结构设计和力学功能为主的机械设计理论，发展结构、驱动、功能共生和演变的设计方法。
(2)需要认识细胞和基因在其自繁衍和自我复制过程中的规律，通过这一规律，设计初始状态细胞的组成和结构，使得生命单元按照其自身规律生长。
(3)开展具有可降解、一定工程强度及在一定环境下可活化、可生长的生命体的材料、制造工艺和工程控制方法研究。
3.2 5D打印的生命单元调控方法与活性保持
5D打印中，生命体单元是进行组织生长与发育的基础，有机的细胞或基因的有机组合是后期功能呈现的核心，制造中需要进行单细胞和基因的微纳尺度的生命单元的堆积，需要研究其堆积的原理以及相互之间的作用关系，通过调节细胞之间的关系，为组织生长和功能再生提供三维空间结构和功能的调控能力。5D打印的最大特点是生命体的功能再生，保证生命体的活性是根本，因此，生命体的制造需要提供与其匹配的培养环境，包括培养液中的养分、氧气与二氧化碳等气氛环境等的调控，形成生物环境与打印工艺的复合。
3.3 功能形成机理与构件功能形成
开展不同材料、结构在一定环境下生长为不同组织和功能的细胞/组织的机理研究和工艺创新十分重要。5D打印的初始结构和功能需要在特定环境下发展形成最终功能，这其中需要认识功能的形成与设计制造的关系，需要认识功能和多细胞体系随时间推移功能变化的规律，包括细胞互联和相互作用的关系，通过细胞之间的作用，构建能量(肌细胞)释放或者信息(神经元)传递功能，为利用这些功能研发具有多功能的器件提供技术基础。
3.4 信息载体与传导组织构建
生命体是可由信息控制的功能组织。动物及人类的神经元担负了这一功能。在5D打印中，需要探究：现有研究采取什么材料和何种结构替代神经的作用，如何通过电或者化学信息来正确传导信息并驱动组织形成其不同的功能。研究神经和类脑组织将有助于建立基于人类自然特色的信息传递组织，进一步向类脑自然组织的人工智能发展。目前的人工智能的深度学习是按照模型猜想、数据训练及随时学习积累，甚至采用了生物遗传算法，来实现人工智能的功能的,恰如飞机代替了鸟类。将来，类脑会采用5D打印方法把芯片植入再创的器官或者人造器官中，或者学习人脑脑神经的随机互联来制造功能强大的生物芯片，或者采用基因来完全仿制一个具有生物活性的大脑，其中，如何实现人造大脑与人体原器官以及若干人造器官的信息收集、决策控制与驱动等都是有待研究和创新的领域。
3.5 多功能器件或组织的制造与功能评价
5D打印技术实现中，需要基于设计、制造和原理的认识，以特定的器官或生物器件为目标，进行系统的结构设计与功能生长设计，认识在生命体单元的发展中，如何调控5D打印的细胞或基因组合，如何控制打印过程中工艺对生命体的损伤，如何调控形成的器官或器件具有的功能以及在细胞生长中的干预和导向；需要认识5D打印与功能形成的关系，对多功能器件或组织的功能进行评价和测定，形成生命体单元—功能设计—无损伤打印—功能生成的研究体系，为研制具有生命体的器官和器件提供技术支撑。
4 发展方向
5D打印将使得人类从木材、金属、硅材料等向生命体材料发展，其制造不再是不可变的结构，而是具有功能再生的器件。在这个过程中需要建立功能引导变革性设计与制造技术，通过学科交叉融合来推动制造技术的发展。以下介绍西安交通大学在此方面的探索工作。
4.1 心肌组织的制造
心肌梗死是严重威胁人类生命健康的重大疾病，现有的工程化心肌补片由于缺乏电生理特性，故无法与宿主心肌形成电信号导通进而实现收缩同步，严重影响梗死心肌的功能恢复。由此需要研究将导电传感功能融入传统心肌组织，笔者所在研究团队通过多材料微纳3D打印技术实现导电传感心肌支架的一体化可控制造，为探索心肌梗死的发病机理与治疗提供新手段[2]。该研究成果将推动生物制造研究从传统支架结构制造向智能导电传感支架制造方向发展。
LEI等[3]模拟自然心肌组织细胞外基质的微纳米纤维结构，研究了微米/亚微米尺度复合导电纤维多材料静电打印工艺方法。利用熔融静电打印方法制备了直径为9.5 ± 1.5 μm的聚己内酯(PCL)微米纤维；利用溶液静电打印制备了直径为470±76 nm的聚3，4-乙撑二氧噻吩/聚苯乙烯磺酸盐-聚氧化乙烯(PEDOT:PSS-PEO)导电纤维。PEDOT:PSS-PEO亚微米纤维具有良好的导电性，其导电率为1.72 × 103 S/m。通过层层累积的方法，制备了具有多层不同取向的微米纤维支架和微米/亚微米导电支架，所制备的多层支架在纤维方向具有良好的力学性能，其弹性模量约为13.0 MPa。导电性的测量结果表明，PEDOT:PSS-PEO亚微米导电纤维的添加显著增强了支架的导电性，并且，微米/亚微米导电支架在水环境中可以保持稳定的导电性，这为后续的细胞实验奠定了基础，相关结果如图1所示。
原代心肌细胞是构成心肌组织的最重要细胞，为心脏的收缩和血液流动提供动力。MAO等[4]采用静电打印的微米/亚微米复合导电纤维支架研究了其对大鼠原代心肌细胞定向生长及同步跳动的影响。复合培养8天后发现，在微米纤维支架中，原代心肌细胞可以沿着微米PCL纤维定向生长，沿纤维方向表达了少量心肌特异性蛋白α-actinin和CX43；而在微米/亚微米导电支架中，心肌细胞不仅可以沿微米PCL纤维生长，还可以在亚微米导电纤维上生长，形成具有取向性的复杂细胞网络，表达了大量的α-actinin和CX43两种蛋白。荧光定量分析表明，心肌特异性蛋白α-actinin 和CX43在微米/亚微米导电支架中的表达显著高于微米纤维支架，证明了亚微米导电纤维提高了支架的导电性，增强了心肌细胞间电信号传递、特异性蛋白的表达和跳动能力。此外，分层定向的微米/亚微米导电支架更有利于原代心肌细胞的同步跳动。相关结果如图2所示。
(a)弹性模量 (b)阻抗分析
图1 静电打印的微米纤维/亚微米导电纤维复合支架及其性能表征[2]
Fig.1 Fabrication and characterization of micro/nanofibrous conductive scaffolds based on electrohydrodynamic printing
4.2 类脑组织制造
脑科学是当今科学研究重要发展方向之一，也是世界各国间科学竞争的制高点之一。2013年美国总统奥巴马宣布启动脑科学计划(Brain Initiative)，欧盟国家、日本随即予以响应，分别启动欧洲脑计划(The Human Brain Project)以及日本脑计划(Brain/Minds Project)。我国“十三五”规划的100个重大项目中，“脑科学与类脑研究”列第四位。世界卫生组织的统计数据表明，脑疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病、自闭症、抑郁症等)给全球社会造成的负担已超过心血管疾病和癌症。由于对其发病机制的认识有限，几乎所有的病例都缺乏有效的治疗。在脑科学及脑疾病的研究中，作为研究对象的人脑组织供体缺乏成为其主要的瓶颈，并且动物脑组织无法完全表征人脑组织特征，因此，体外构建接近自然人脑组织的模型是脑科学发展的必然需求。脑组织中的神经元功能与信号发生和交换是形成思维功能的基础，其内部细胞的排列及它们在皮质各层内的类型和密度是大脑皮质分区功能的基础，从“认识脑”到“创造脑”是发展类脑计算机的方向，在体外对脑组织进行形态和功能构建取决于对目标功能部位所对应的神经元类型、构筑结构及神经元组合的仿生设计和精确制造，是生物类脑功能5D打印应该发展的前瞻性方向。
在类脑组织体外构建的设备研发方面，我们设计并搭建了细胞打印/培养一体化系统，可同时实现多种细胞和基质成分的打印，其中打印头打印速度100～1 000 μL/min，x-y工作台移动精度不高于20 μm，可打印组织层厚100～300 μm，打印腔室温度保持为37±1 ℃，氧气和二氧化碳浓度可调且浓度偏差在±1%以内，为实现多细胞类脑组织体外打印提供了设备平台，如图3所示。在打印设备的基础上，针对神经元细胞的打印需求，优化了相应的打印工艺参数，实现了包裹大鼠原代神经元细胞的三维活性神经组织的制备，打印后组织的细胞活性在94%以上。
自然脑组织是由神经元和神经胶质为主的两类神经细胞组成的。我们利用已搭建的制造平台构建了单纯神经元组织、神经元和胶质细胞混合组织，以及神经元和胶质细胞以一定的三维空间结构共同存在的组织模型，实现了活性类脑组织神经元和胶质细胞在体外不同方式和空间结构关系下的共培养[5]。通过研究发现，相对于由体外单纯构建的神经元组织，与胶质细胞相邻但分层存在的神经元在体外可以有更接近自然脑组织的形态和生化表达。该模型的构建，从三维层面为神经胶质细胞和神经元共存的组织模型提供了更为接近自然脑组织的解释和研究基础，也为后续脑科学的开展及不同病理药理研究提供了体外模型的基础。
图2 大鼠原代心肌细胞在微米/亚微米复合导电纤维支架上的定向与同步跳动情况[3]
Fig.2 Cellular orientations and synchronous contraction of rat primary cardiomyocytes on the micro/nanofibrous conductive scaffolds
图3 体外类脑组织打印/培养一体化平台
Fig.3 The system of integrated tissue culture & printing for the biofabrication of brain-like tissue
通过3D打印设备，我们构建了胶质细胞和神经元不同空间结构关系下的组织模型，所构建的模型中间为胶质区域，四周为神经元区域。通过研究验证了胶质细胞与神经元的空间关系对体外神经元的形态发育及功能有很大影响，研究了与神经胶质细胞不同空间位置和距离的神经元轴突的延伸情况(图4)，结果表明，靠近胶质细胞区域的具有较长轴突的神经元(>100 μm)数目远多于远离神经胶质细胞区域，证明了在体外构建的三维活性组织中，胶质细胞的存在有利于神经元突触的形成及生长，即对神经元的生长发育及信号传递有促进作用[6]。
图4 培养至第7天的神经元免疫荧光图像 (不同颜色表示沿Z轴方向不同深度)
Fig.4 The immunofluorescent images of the neurons cultured within the printed three-dimensional tissue in-vivo at Day7, the color bar represents the depth of the tissue
4.3 生物机械共生体
现有机器存在能量转化效率低、灵活性低等局限，具有高能量转化效率、本质安全性、运动灵活性的多自由度柔性类生命机器人是用生命肌肉组织或细胞驱动的生物共生机器的发展方向。为此，需研究类生命机器人多细胞/多材料复合制造方法，为具有生命体和机械体的类生命机器人提供一种从运动功能需求出发，可重复、可定制的快速制造新途径[7-8]。
生命体设计方面,我们设计了一种用于肌细胞培养分化的负泊松比支架微结构，以提高肌细胞分化程度与肌肉组织的收缩力，并为生命体提供必要的保护及生命维持养分，以利于其长期保持活性；生命体制造方面采用3D打印制造生命体构件，通过实验研究了骨骼肌细胞的生长分化情况，扫描电镜等结果表明，骨骼肌细胞可分化形成成熟的肌纤维，为功能化生命体的构建奠定了基础；生命体功能调控方面，搭建了生命体多场耦合刺激平台，研究了仿生理环境富集刺激(例如电刺激、机械刺激等)对生命体驱动性能的调控作用机制。构建了一种以海蛞蝓为仿生原型的爬行生命机械混合机器人。在爬行生命机械混合机器人的设计与制造中，研究了蛞蝓的解剖学结构及其运动方式，建立了运动简化模型并进行了步态分析，在此基础上，设计了类生命机器人的本体结构，依据摩擦力的各向异性设计了其爬行步态，并通过3D打印制作了类生命机器人构件。有关类生命机器人的驱动性能研究方面，建立了基于二阶弹簧阻尼系统机器人的运动学与动力学模型，利用运动学与动力学实验平台开展了机器人驱动性能检测实验(图5)，实验结果表明，在频率50 Hz、电压1 V的方波脉冲刺激下，机器人能以2 mm/s的速度向前爬行[9]。上述研究探索了生命体机器人未来的可能发展方向。
(a)类生命机器人实体
(b)流体动力学分析
图5 爬行类生命机器人的构建
Fig.5 Construction of crawling bio-hybrid robots
5 总结
5D打印的特征是在三维空间制造的基础上，除了增加时间维度外，增加了更为重要的功能再生维度。本文阐述了这一技术五个方面的关键问题：基于功能的生命体结构设计制造、5D打印的生命单元调控方法与活性保持、功能形成机理与构件功能形成、信息载体与传导组织构建、多功能器件或组织的制造与功能评价。结合5D打印理念，以三个方面的案例——心肌组织支架的制造、类脑神经组织制造、爬行生命机械混合机器人的初步研究成果，说明生命组织功能形成的可能途径和初步效果，相关研究为生物制造技术拓展新方向提供了新思路。
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